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蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)定試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/11/6      點(diǎn)擊次數(shù):464

蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)定試劑盒

                                                 

 微量法100T/48S

 

 

   正式實(shí)驗(yàn)之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

蛋白質(zhì)羰基是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標(biāo)志,其含量高低表明蛋白質(zhì)氧化損傷程度的大小,是衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的主要指標(biāo)。

 

測(cè)定原理:

羰基與2,4-er硝基苯肼反應(yīng)生成紅色2,4-er硝基苯腙,在370nm處有特征吸收峰。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、漩渦震蕩儀、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存。

試劑一:粉劑0.1g×5支,4避光保存。(使用前根據(jù)樣品數(shù),每支加1mL水溶解,每支為10個(gè)樣品用量)

試劑二:液體6mL×1瓶,4避光保存。

試劑三:液體6mL×1瓶,4保存。

試劑四:液體15mL×1瓶,4保存。

試劑五:根據(jù)測(cè)定樣品量,將乙酸乙酯和無水乙醇等體積混合。

試劑六:液體60mL×1瓶,4保存。

 

樣品處理:

1.        組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,于44000g離心10min,取上清,加入0.1mL試劑一,室溫放置10min4,10000g離心10min,取上清待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體樣本:直接測(cè)定。

 

測(cè)定步驟和操作表:

1、   分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至370nm。

2、   操作表


對(duì)照管

測(cè)定管

樣品(μL

60

60

試劑二(μL


120

試劑三(μL

120


混勻,37避光反應(yīng)1h

試劑四(μL

150

150

靜置5min,4,12000g離心15min,棄上清,留沉淀

試劑五(μL

300

300

漩渦混勻,4,12000g離心10min,棄上清,留沉淀

試劑五(μL

300

300

漩渦混勻,4,12000g離心10min,棄上清,留沉淀

試劑五(μL

300

300

漩渦混勻,4,12000g離心10min,棄上清,留沉淀

試劑六(μL

300

300

漩渦混勻,37溫育15min,沉淀全部溶解后,4,12000g離心15min,取上清200μL微量石英比色皿/96孔板中,測(cè)定A370。ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管

 

計(jì)算公式:

a用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1.        按照樣本蛋白濃度計(jì)算

蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/mg prot= [ΔA370×V反總÷ε×d]÷(V×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr

2.        按照樣本重量計(jì)算

蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/g 鮮重)= [ΔA370×V反總÷ε×d]÷(W ×V÷V樣總) =0.227×ΔA370÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/104cell= [ΔA370×V反總÷ε×d]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V÷V樣總) =0.227×ΔA370÷細(xì)胞數(shù)量

4.        按照液體體積計(jì)算

蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/mL= [ΔA370×V反總÷ε×d]÷V=0.227×ΔA370

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.3 mL;ε:羰基毫摩爾消光系數(shù),22 L/mmol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.06 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,W:樣本質(zhì)量,g

 

b96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/mg prot= [ΔA370×V反總÷ε×d]÷(V×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr

2. 按照樣本重量計(jì)算

蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/g 鮮重)= [ΔA370×V反總÷ε×d]÷(W ×V÷V樣總) =0.454×ΔA370÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/104cell= [ΔA370×V反總÷ε×d]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V÷V樣總) =0.454×ΔA370÷細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/mL= [ΔA370×V反總÷ε×d]÷V=0.454×ΔA370

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.3 mL;ε:羰基毫摩爾消光系數(shù),22 L/mmol/cm;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.06 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,W:樣本質(zhì)量,g

 

 

注意事項(xiàng):

1. 試劑一使用前根據(jù)要測(cè)定的樣品數(shù)現(xiàn)配,配置好后4℃保存,若變?yōu)楹谏?,則不能使用。

2. 試劑二見光易分解,反應(yīng)需嚴(yán)格避光。


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