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小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書

發(fā)布時間:2023/5/16      點擊次數(shù):1016

小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。

 檢測范圍:                                                          96T

25 ng/L-800 ng/L

 

使用目的:

本試劑盒用于測定小鼠血清,血漿及相關(guān)液體樣本中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。用純化的小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入腫瘤壞死因子α(TNF-α),再與HRP標記的腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,經(jīng)過徹di洗滌后加底物TMB顯色。TMBHRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度。

試劑盒組成

1

30倍濃縮洗滌液

20ml×1

7

終止液

6ml×1

2

酶標試劑

6ml×1

8

標準品(1600 ng/L

0.5ml×1

3

酶標包被板

12孔×8

9

標準品稀釋液

1.5ml×1

4

樣品稀釋液

6ml×1

10

說明書

1

5

顯色劑A

6ml×1

11

封板膜

2 

6

顯色劑B

6ml×1/

12

密封袋

1

標本要求

1.標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

操作步驟

1.         標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

800 ng/L

5號標準品

150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

400 ng/L

4號標準品

150μl5號標準品加入150μl標準品稀釋液

200 ng/L

3號標準品

150μl4號標準品加入150μl標準品稀釋液

100 ng/L

2號標準品

150μl3號標準品加入150μl標準品稀釋液

50 ng/L

1號標準品

150μl2號標準品加入150μl標準品稀釋液

 

 

2.         加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

3.         溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

4.         配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.         洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

6.         加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。

7.         溫育:操作同3。

8.         洗滌:操作同5。

9.         顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10分鐘.

10.     終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

11.     測定:以空白孔調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。


計算

  以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。

注意事項

1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。

3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

4.  請每次測定的同時做標準曲線,最好做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。

5.  封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

6.底物請避光保存。

7.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9.本試劑不同批號組分不得混用。

保存條件及有效期

1.試劑盒保存:2-8。

2.有效期:6個月


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