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羥脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/4/3      點擊次數(shù):466

羥脯氨酸Hydroxyproline,HYP試劑盒說明書

                                                      微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

HYP是機體膠原蛋白主要成分之一,膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等,因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標(biāo)。

 

測定原理:

樣品經(jīng)水解產(chǎn)生游離的HYP,進一步被氯胺T氧化,氧化產(chǎn)物與對二甲氨基苯j(luò)ia醛反應(yīng),產(chǎn)生紅色化合物,在560nm處有特征吸收峰。通過測定樣品水解液560nm吸光值,可計算HYP含量。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、烘箱、玻璃管、離心機、水浴鍋、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、無水乙醇、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

組織提取液:6mol/L鹽酸,自備。濃鹽酸:H2OV/V= 1:1,室溫保存。

細胞提取液:液體100mL×1瓶,4保存。

試劑一:液體6mL×1瓶,4避光保存。

試劑二:液體6mL×1瓶,4避光保存。

 

羥脯氨酸提?。?/span>

1.        組織稱取約0.2g樣品于玻璃管,加入2mL的組織提取液,置于110烘箱,水解612小時,用提取液定容至2mL,12000g25,離心20min,取上清待測。

2.        細胞取約500萬個細胞,加入1mL的細胞提取液,于高壓消毒器中15磅保持30min,自然降壓后待測。

3.        血清游離羥脯氨酸提?。喝?/span>0.1mL血清,加入0.5mL無水乙醇使蛋白質(zhì)沉淀,8000g4℃離心5min。將上清倒入另一個EP管,氮吹或沸水浴將乙醇揮發(fā)干。冷卻后再加入0.2mL50%異丙醇,充分溶解混勻待測。

 

測定操作表:

1、   分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至560nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   操作表


對照管

測定管

樣本(µL


60

試劑一(µL

60

60

混勻,室溫靜置20min

試劑二(µL

60

60

H2OµL

180

120

混勻,60,20min,取出后25靜置15 min,取200µL于微量石英比色皿/96孔板中檢測560nm吸光值。ΔA=A測定-A對照

 

 

 

羥脯氨酸含量計算公式:

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=64.875x+ 0.0251,R2=0.9991

1)按樣品重量計算

組織羥脯氨酸含量(mg/g 鮮重=ΔA-0.0251÷64.875×V反總÷(V÷V樣總×W)

                        = 0.154×ΔA-0.0251÷W

2)按細菌或細胞密度計算

細胞羥脯氨酸含量(mg/104 cell=ΔA-0.0251÷64.875×V反總÷V×V樣總÷細胞數(shù)量(萬個)= 0.077×ΔA-0.0251÷ 細胞數(shù)量(萬個)

3)按血清體積計算

HYP含量(mg/mL=ΔA-0.0251÷ 64.875×V反總÷V×2

                 =0.154×ΔA-0.0251

V反總:反應(yīng)總體積,0.3 mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.06mL;V樣總:加入提取液體積, mL;W:樣本重量,g

b.96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=32.4375x+ 0.0251,R2=0.9991

1)按樣品重量計算

HYP含量(mg/g 鮮重=ΔA-0.0251÷32.4375×V反總÷(V÷V樣總×W)

                = 0.308×ΔA-0.0251÷W

2)按細菌或細胞密度計算

HYP含量(mg/104 cell=ΔA-0.0251÷32.4375×V反總÷V×V樣總÷細胞數(shù)量(萬個)= 0.154×ΔA-0.0251÷細胞數(shù)量(萬個)

3)按血清體積計算

HYP含量(mg/mL=ΔA-0.0251÷32.4375×V反總÷V×2

                 = 0.308×ΔA-0.0251

V反總:反應(yīng)總體積,0.3 mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.06mL;V樣總:加入提取液體積, mLW:樣本重量,g;2,血清吹干后復(fù)溶的倍數(shù)。

 

注意事項:

1、   吸光值大于0.8,樣品適當(dāng)稀釋再測定,注意計算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、   試劑有一定的毒性,請操作時做好防護措施,防止吸入或與皮膚接觸。

3、   Z低檢出限為3.8mg/L。


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