NADP磷酸酶（NADPase）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                  微量法 100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

NADPase主要存在于植物組織中，是生物體內(nèi)唯yi催化NADP⁺降解為NAD⁺的酶，與NADK一起調(diào)控NAD和NADP之間的平衡。

測(cè)定原理：

NADPase能夠催化NADP⁺水解為NAD+和無(wú)機(jī)磷的反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來(lái)測(cè)定NADPase活性。

所需的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體15 mL×1瓶， 4℃保存。

試劑二：粉劑×4支，-20℃保存；用時(shí)加入1 mL試劑一充分溶解備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑三：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑四：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑五：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。

試劑六：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑六20倍稀釋?zhuān)慈?/span> 0.5mL試劑六加9.5蒸餾水，充分混勻。

定磷試劑的配制：按H₂O: 試劑三:試劑四:試劑五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑

              應(yīng)為淺黃色，若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

操作步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）

37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱5min

37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心5min，取上清

3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

混勻，25℃室溫放置30min，在 660nm處，記錄各管吸光值。

注意事項(xiàng)：

1、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格，要沒(méi)有一點(diǎn)磷，若試管放過(guò)磷酸或磷酸鹽緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，再用自來(lái)水沖，最后用蒸餾水沖干凈。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。

2、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管和對(duì)照管只要做一次即可。

NADPase酶活性計(jì)算：

1、按組織蛋白濃度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè) NADPase活力單位。

NADPase (μmol/h/mg prot)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷

(V樣×Cpr)÷T=5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算：

定義：每小時(shí)每g組織NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè) NADPase活力單位。

NADPase (μmol/h /g鮮重)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷(W× V樣÷V樣總)÷T=5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.04mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

NADP磷酸酶（NADPase）試劑盒僅供科研！