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豬多殺性巴氏桿菌(SPA)核酸檢測(cè)試劑盒

發(fā)布時(shí)間:2024/12/10      點(diǎn)擊次數(shù):148

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:豬多殺性巴氏桿菌(SPA)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法) 

Name:Swine Pasteurellosis Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

多殺性巴氏桿菌是一種常見(jiàn)病原菌,可感染豬、牛、家禽等多種動(dòng)物,引起豬肺疫、牛出血性敗血癥、禽霍   亂等多種臨床疾病[1]。

本試劑盒適用于檢測(cè)氣管分泌物拭子、肺組織等樣本中的豬多殺性巴氏桿菌,用于豬多殺性巴氏桿菌感染的   輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù),設(shè)計(jì)一對(duì)豬多殺性巴氏桿菌特異性引物,結(jié)合一條特異性探針[2],用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)豬多殺性巴氏桿菌的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),用于科研實(shí)驗(yàn)中對(duì)可疑感染者的病原學(xué)檢測(cè)。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

SPA 反應(yīng)液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

SPA 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說(shuō)明:不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次,有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺豬,無(wú)菌采集肺病變部位或病變/非病變部位交界處的樣品;生豬滅菌棉拭子沾取氣管分泌物,   放入無(wú)菌試管中

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長(zhǎng)期保存可置-70℃,但不能超過(guò) 6 個(gè)月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸, 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1樣本前處理

組織樣品:稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進(jìn)行核酸提取,請(qǐng)按照    試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑SPA 反應(yīng)液酶液

用量(樣本數(shù)為 N)20μL1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21μL/管。

3.加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;

熒光通道選擇: 檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇

ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)

11 cycle95℃10min

240 cycles94℃15sec

55℃30sec

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽(yáng)性:檢測(cè)通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線;

可疑:檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測(cè),如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤38,且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線, 判定為陽(yáng)性,否則為陰性;

陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。

6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:Ct 值>38 或無(wú) Ct 值;

陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,且Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

7.檢測(cè)方法的局限性

1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

2.樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;

3.陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;

4.病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

5.不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

6.試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;

7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完-全混勻并短暫離心;

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]曾靜雯, 劉慧芳, 沈琴芳, 等. 多殺性巴氏桿菌鑒定與特性研究的分子生物學(xué)方法[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2006.

[2]李鵬, 馬艷嬌, 夏偉, 等. 豬肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌和豬胸膜肺炎放線桿菌三重 PCR 檢測(cè)方法的建立. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2010.


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