葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）試劑盒說(shuō)明書

                                      微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

GOD（EC 1.1.3.4）廣泛存在于動(dòng)物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并產(chǎn)生H₂O₂，是生物體中產(chǎn)生活性氧的代謝途徑之一。

測(cè)定原理：

GOD催化產(chǎn)生H₂O₂，過(guò)氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在500 nm有特征吸收峰，顏色深淺與GOD活性成線性關(guān)系。

試驗(yàn)中所需的儀器和設(shè)備：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

緩沖液：液體30mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入10mL緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存一個(gè)月；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入10mL緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存一個(gè)月；

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至500nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   試劑一和試劑二的配制：參見試劑的組成和配制。

3、煮沸樣本的準(zhǔn)備：取200μL樣本至新的EP管中，95℃水浴10min，冷卻至室溫后，8000g 4℃離心10min，取上清作為對(duì)照管的煮沸樣本待測(cè)。

4、測(cè)定操作表

混勻，35'C保溫15min后，于500nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

GOD活力單位的計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

回歸方程為y = 2.8348x - 0.0169；x為H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為ΔA。

1、血清（漿）GOD活力的計(jì)算

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/mL）= (ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷V樣÷T×1000=58.8×(ΔA+0.0169)

2、細(xì)菌、細(xì)胞或組織GOD活力的計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/mg prot）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷(V樣×Cpr) ×1000÷T

=58.8×(ΔA+0.0169)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/g鮮重）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ×1000÷T

=58.8×(ΔA+0.0169)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每一萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/10⁴ cell）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ×1000÷T

=0.118×(ΔA+0.0169)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.125mL； V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

 b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

回歸方程為y = 1.4174x - 0.0169；x為H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為ΔA。

1、血清（漿）GOD活力的計(jì)算

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/mL）= (ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反總÷V樣÷T×1000=118×(ΔA+0.0169)

2、細(xì)菌、細(xì)胞或組織GOD活力的計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/mg prot）=(ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反總÷(V樣×Cpr) ×1000÷T

=118×(ΔA+0.0169)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/g鮮重）=(ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ×1000÷T

=118×(ΔA+0.0169)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每一萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/10⁴ cell）=(ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ×1000÷T

=0.235×(ΔA+0.0169)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.125mL； V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)