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榛子源性成分探針?lè)晒舛縋CR試劑盒使用方法

更新時(shí)間:2022-04-26      點(diǎn)擊次數(shù):790


使用方法

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 個(gè) 10 倍稀釋度為例)。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬(wàn)不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本 產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.標(biāo)記 個(gè)離心管,分別為 65,43,21。


2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭, 下同。 

3. 在 號(hào)管中加入 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供),充分震 蕩 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 

4. 換槍頭,在 號(hào)管中加入 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),充分震蕩 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 

5. 換槍頭,在 號(hào)管中加入 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),充分震蕩 分鐘,得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。


二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 個(gè)樣品待提取,最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取,多出的是 PC(樣品制備陽(yáng) 性對(duì)照)和 NC(樣品制備陰性對(duì)照)??梢匀£?yáng)性對(duì)照的 1000 倍稀釋液 10μL 再加上一定量的水,使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致,以此作 為 PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼 容。

三、Probe qPCR 反應(yīng)(20μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行)

9.如果做定量分析并且只做 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用 水做模板),個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照(用第 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模 板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好 后最后加)


成分/每管樣品管 N+2 個(gè)PCR 陰性 對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管(1-6 管)
2×Probe qPCR MagicMix10 μL10 μL10 μL
榛子源性成分探針?lè)?qPCR 引物-探針混合液 μLμLμL
N+2 個(gè)待測(cè) DNA 模板μL

超純水
μL
第 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液 1-6 號(hào))

μL(號(hào)樣到 號(hào)管,號(hào)樣到 號(hào)管

11. 蓋上蓋子后上機(jī),按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR

過(guò)程溫度時(shí)間
預(yù)變性9510 min
PCR 反應(yīng) 45 個(gè)循環(huán))9515 sec
6060 sec(采集 FAM 通道的熒 光信號(hào))
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